什么是熒光顯微鏡?

　　熒光顯微鏡是以紫外線為光源， 用以照射被檢物體， 使之發(fā)出熒光， 然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運輸、化學物質(zhì)的分布及定位等。

　　細胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光;另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進行定性和定量研究的工具之一。

　　熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別：

　　1.照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上;

　　2.光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡;

　　3.有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人目。

　　熒光顯微鏡的應(yīng)用與注意

　　使用：

　　一、將材料片放在顯微鏡的載物臺上。

　　二、打開熒光顯微鏡穩(wěn)壓器，然后啟動紫外燈，紫外燈15min內(nèi)不得關(guān)閉，關(guān)閉后3min內(nèi)不得再啟動。

　　三、將激發(fā)濾光片轉(zhuǎn)至v，分色片調(diào)到v，選用495或475nm阻擋濾光片。

　　四、選用uvFL40、uvFL100熒光接物鏡鏡檢。

　　五、在玻片上加無熒光油，先用40 x，再用100 x調(diào)焦鏡檢.呈現(xiàn)熒光。

　　六、因熒光物質(zhì)受紫外光照射時隨時間的增長熒光逐漸變?nèi)�，因此鏡檢時應(yīng)經(jīng)常變換視野。

　　七、亦可用uvFL10或uvFL20低倍鏡鏡檢材料(用低倍鏡時不加無熒光油)。

　　熒光圖像的記錄方法：

　　熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術(shù)科學的發(fā)展，在不同程度上采用客觀指標記錄判斷結(jié)果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。

　　熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統(tǒng)裝置。

　　注意事項：

　　(1)嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。

　　(2)應(yīng)在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標本。

　　(3)防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡。

　　(4)檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱;標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱;所以，最多不得超過2～3h。

　　(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應(yīng)集中檢查，以節(jié) 省時間，保護光源。天熱時，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。

　　(6)標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。

　　(7)熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“一”—無或可見微弱熒光�！�+”—僅能見明確可見的熒光�！�++”—可見有明亮。