關鍵詞：流式細胞儀

　　目的：流式細胞儀開機程序、預設獲取模式文件、設定和調整、樣品分析、關機程序

　　一.開機程序

　　1.檢查穩(wěn)壓器電源，打開電源，穩(wěn)定5分鐘。

　　2.打開儲液箱，倒掉廢液, 并在廢液桶中加入400ml漂白水原液。打開壓力閥，取出鞘液桶，將鞘液桶加至4/5滿(一般可用三蒸水，做分選必須用PBS或FACSFlow)，合上壓力閥。確實蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善安置。

　　3.將FACSCalibur開關打開，此時儀器功能控制鈕的顯示應是STANDBY，預熱5-10分鐘。排出過濾器內的氣泡。

　　4.如果需要打印，打開打印機電源。

　　5.打開電腦,等待屏幕顯示出標準的蘋果標志。

　　6.執(zhí)行儀器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的氣泡。

　　7.分析樣品時，先用FACAFlow 或PBS進行HIGH RUN約2分鐘。

　　做過分選后，每次開機后需沖洗管道：向分選裝置上裝上兩個50ml離心管，不接通濃縮系統(tǒng)，摁下右下角白色按鈕開始沖洗。待自動停止后接通濃縮裝置，同上法沖洗一次。

　　二.預設獲取模式文件(Acquisition Template Files)

　　1.從蘋果標志中選擇CELLQuest見一個新視窗，可利用此視窗編輯一個獲取模式文件。

　　2.選取屏幕左列繪圖工具中的Dot plot，繪出一個或多個Dot Plots(點圖)。從Dot Plot對話框中選取Acquisition作為圖形資料來源，并確定適當的x軸和y軸參數。

　　3.選取屏幕左列繪圖工具中的Histogram，同上法可繪出Histogram(直方圖)。

　　4.將此視窗命名后儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夾中，下次進行相同實驗時可直接調用。

　　本計算機中已設定兩個模式文件：ACQ和EXP，儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夾中，ACQ用于細胞DNA檢測，EXP用于細胞表面標志分析。

　　三.用CELLQuest進行儀器的設定和調整

　　1.從蘋果畫面中選取CELLQuest，進入CELLQuest后在File指令欄中打開合適的獲取模式文件。

　　2.從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer(快捷鍵： +B)進行電腦和儀器的連機。將出現(xiàn)的Acquisiton Control對話框移至合適位置。

　　3.從Cytometer指令欄中，開啟Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四個對話框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數據時隨時調整獲取條件。也可以用 +1，2，3，4獲得此四個對話框。

　　4.在Detectors/Amps對話框中，先為每個參數選擇適當的倍增模式(amplifier mode)：線性模式Lin或對數模式Log。一般進行細胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細胞亞群時，F(xiàn)SC和SSC多以線性模式Lin測量，且DDM Param選擇FL2，而FL1, FL2與FL3則以對數模式Log測量;分析細胞DNA含量時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3皆以Lin進行測量，且DDM Param選擇FL2;分析血小板表型時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3等均以Log進行測量。

　　5.放上待檢測的樣品，將流式細胞儀設定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。

　　6.在Acquisiton Control對話框中，選取Acquire，開始獲取細胞。在以下的儀器調整過程中隨時選取Pause，Restart以觀察調整效果。未完全調整好之前不要去掉SETUP前的“”。

　　7.在Detectors/Amps對話框中，調整FSC和SSC探測器中的信號倍增度：PMT voltages(粗調)與Amp Gains(細調)，使樣品信號出現(xiàn)在FSC-SSC點圖內,且三群細胞合理分布。

　　8.在Threshold 對話框中選擇適當的參數設定Threshold，并調整Threshold的高低，以減少噪音信號(細胞碎片)。一般做細胞表型時用FSC-H而做DNA時用FL2-H。Threshold并不影響檢測器對信號的獲取，但可改善畫面質量。

　　9.從屏幕左列繪圖工具中選取Region(區(qū)域)，并在靶細胞周圍設定區(qū)域線，即通常所說的門。圈定合適的細胞群可使儀器調整更為容易。

　　10.Detectors/Amps對話框中，調整熒光檢測器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根據所用的熒光陰性對照樣品調整細胞群，使之分布在正確的區(qū)域內。

　　11.在Compensation對話框中，根據所用的調補償用標準熒光樣品調整雙色(或多色)熒光染色所需的熒光補償。比如應該為FL1+ FL2- 的細胞群卻分布在FL1+ FL2+區(qū)域內，則需調大FL2-?%FL1中的“?”，并從FL1-FL2點圖中觀察新的調整是否恰當

　　12.在Status對話框中可見：Laser Power:正常值—Run/Ready為14.7mW，Standby為5mW;Laser current:正常值為6Amps左右。

　　13.調整好的儀器設定可在Instrument Settings對話框中儲存，下次進行相同實驗時可調出使用，屆時只需微調即可。

　　本計算機中已有三個名叫儲存于FACStation G3 \BD Applications \CELLQuest Folder \IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files \CalibFile和Mast-Cell-Set的參數文件，前二者可用于分析人白細胞，后者用于分析小鼠肥大細胞。

　　四.通過預設的獲取模式文件進行樣品分析

　　1.從蘋果標志中選擇CELLQUEST，新視窗出現(xiàn)后從File指令欄中選擇Open，打開預設的獲取模式文件。

　　2.從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer進行電腦和儀器的連機。將出現(xiàn)的Acquisiton Control對話框移至合適位置。

　　3.從Cytometer指令欄中選取Instrument Settings，在其對話框中選擇Open以調出以前存儲的相同實驗的儀器設定，按Set 確定。

　　4.在Acquire指令欄中，選擇Acquisition&Storage決定儲存的細胞數，參數，信號道數。其中Resolution在做細胞表面標志時選擇256，做DNA時選擇1024。Parameter Saved…則根據不同的檢測對象選擇不同的參數。

　　5.在Acquire指令欄中，選擇Parameter Description，以決定文件存儲位置(folder)，文件名稱(file)，樣品代號以及各種參數的標記(panel)，即安排tube1，2，3…的檢測參數。一般本儀器獲取的數據按照檢測對象的不同分別儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \IMM 和DNA 文件夾中。文件根據日期命名。

　　6.在Cytometer指令欄中，選擇Counters，將此對話框移至合適位置，以便于隨時觀察events計數。

　　7.將樣品試管放至檢測區(qū)，在Acquire Control對話框中選取Acquire以啟動樣品分析測定。

　　8.微調儀器設定，待細胞群分布合適后選擇Acquire Control對話框中Pause, Abort, 去除Setup前的“”，開始正式獲取信號，存儲數據。

　　9.當一定數目的細胞被測定后，獲取會自動停止，并會自動存儲數據。重復步驟7，繼續(xù)分析下一個樣品，直到所有的樣品數據分析完畢。

　　當所有樣品分析分析完畢，即換上三蒸水，并將流式細胞儀置于“STANDBY”狀態(tài)，以保護激光管。

　　五.關機程序：

　　1.從File中選擇Quit, 退出軟件，選擇Don’t Save至蘋果屏幕。

　　2.用4ml 1：10稀釋的漂白水作樣品，將樣品置于旁位(vacuum is on)，以外管吸去約2ml，在將樣品架置于中位(vacuum is off)，再HIGH RUN 5分鐘(內管吸去2ml)。

　　3.改用三蒸水4ml作樣品,同上處理。

　　4.按Prime三次。

　　5.此時儀器自動轉為STANDBY狀態(tài)，換2ml三蒸水。必須在儀器處于“STANDBY”狀態(tài) 10分鐘后再依次關掉計算機、打印機、主機、穩(wěn)壓電源，以延長激光管壽命，并確保應用軟件的正常運行。

　　6.填寫使用登記表。